Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ:
МЕТОДЫ, РЕЗУЛЬТАТЫ, ОЦЕНКА

Решедько Галина Константиновна,
к.м.н., ассистент кафедры клинической фармакологии
Смоленской государственной медицинской академии
214019, г.Смоленск, ул.Крупской, 28, а/я № 5.
Тел.: +7(0812) 61 13 01, 61 13 27, Факс: (0812) 61 12 94,
E-Mail: galina@antibiotic.ru

Содержание

В лекции рассмотрены основные методы определения чувствительности in vitro микроорганизмов к антимикробным препаратам (диско-диффузионный, Е-тестов, методы разведения). Отражены подходы к эмпирическому и этиотропному назначению антибиотиков в клинической практике. Обсуждены вопросы интерпретации результатов определения чувствительности с клинической и микробиологической точек зрения.

В настоящее время в клинической практике существуют два принципа назначения антибактериальных препаратов: эмпирическое и этиотропное. Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре, а также результатах контролируемых клинических исследований. Несомненным преимуществом эмпирического назначения химиопрепаратов является возможность быстрого начала терапии. Кроме того, при таком подходе исключаются затраты на проведение дополнительных исследований.

Однако при неэффективности проводимой антибактериальной терапии, при нозокомиальных инфекциях, когда затруднительно предположить возбудителя и его чувствительность к антибиотикам стремятся проводить этиотропную терапию. Этиотропное назначение антибиотиков предполагает не только выделение возбудителя инфекции из клинического материала, но и определение его чувствительности к антибиотикам. Получение корректных данных возможно только при грамотном выполнении всех звеньев бактериологического исследования: от взятия клинического материала, транспортировки его в бактериологическую лабораторию, идентификации возбудителя до определения его чувствительности к антибиотикам и интерпретации полученных результатов.

Вторая причина, обусловливающая необходимость определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам — это получение эпидемиологических данных о структуре резистентности возбудителей внебольничных и нозокомиальных инфекций. В практике эти данные используют при эмпирическом назначении антибиотиков, а также для формирования больничных формуляров.

Методы определения чувствительности к антибиотикам

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: диффузионные и методы разведения.

При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 по McFarland) и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35 о -37 о С в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах (рис. 1).

Рисунок 1. Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом.

Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 2). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Рисунок 2. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.

Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.

Методы разведения основаны на использовании двойных последовательных разведений концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (например от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). При этом антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон) или в агар. Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке. После инкубации в течение ночи при температуре 35 о -37 о С проводят учет полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 3).

Рисунок 3. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде.

Интерпретация результатов определения чувствительности

На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные (рис. 4). Для разграничения этих трех категорий чувствительности (или резистентности) между собой используют так называемые пограничные концентрации (breakpoint) антибиотика (или пограничные значения диаметра зоны подавления роста микроорганизма).

Рисунок 4. Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий в соответствии со значениями МПК.

Пограничные концентрации не являются неизменными величинами. Они могут пересматриваться, в зависимости от изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Разработкой и пересмотром критериев интерпретации занимаются ведущие специалисты (химиотерапевты и микробиологи), входящие в специальные комитеты. Одним из них является Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам США (National Committee for Clinical Laboratory Standards — NCCLS). В настоящее время стандарты NCCLS признаны в мире и используются как международные для оценки результатов определения чувствительности бактерий при многоцентровых микробиологических и клинических исследованиях.

Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.

Чувствительные микроорганизмы (susceptible)

Клинически к чувствительным относят бактерии (с учетом параметров, полученных in vitro), если при лечении стандартными дозами антибиотика инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, наблюдают хороший терапевтический эффект.

При отсутствии достоверной клинической информации подразделение на категории чувствительности базируется на совместном учете данных, полученных in vitro, и фармакокинетики, т.е. на концентрациях антибиотика, достижимых в месте инфекции (или в сыворотке крови).

Резистентные микроорганизмы (resistant)

К резистентным (устойчивым) относят бактерии, когда при лечении инфекции, вызванной этими микроорганизмами, нет эффекта от терапии даже при использовании максимальных доз антибиотика. Такие микроорганизмы имеют механизмы резистентности.

Микроорганизмы c промежуточной резистентностью (intermediate)

Клинически промежуточную резистентность у бактерий подразумевают в случае, если инфекция, вызванные такими штаммами, может иметь различный терапевтический исход. Однако лечение может быть успешным, если антибиотик используется в дозировке, превышающей стандартную, или инфекция локализуется в месте, где антибактериальный препарат накапливается в высоких концентрациях.

С микробиологической точки зрения к бактериям с промежуточной резистентностью относят субпопуляцию, находящуюся в соответствии со значениями МПК или диаметра зон, между чувствительными и резистентными микроорганизмами. Иногда штаммы с промежуточной резистентностью и резистентные бактерии объединяют в одну категорию резистентных микроорганизмов.

Необходимо отметить, что клиническая интерпретация чувствительности бактерий к антибиотикам является условной, поскольку исход терапии не всегда зависит только от активности антибактериального препарата против возбудителя. Клиницистам известны случаи, когда при резистентности микроорганизмов, по данным исследования in vitro, получали хороший клинический эффект. И наоборот, при чувствительности возбудителя может наблюдаться неэффективность терапии.

В определенных клинических ситуациях, когда недостаточно результатов исследования чувствительности обычными методами, определяют минимальную бактерицидную концентрацию.

Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) — наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определенного периода времени.

Значение МБК используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных. Частными случаями для определения МБК могут быть, например, бактериальный эндокардит, остеомиелит или генерализованные инфекции у пациентов с иммунодефицитными состояниями.

В заключение хотелось бы отметить, что на сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.

Таблица 1. Критерии интерпретации чувствительности бактерий

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам

Для определения чувствительности бак­терий к антибиотикам (антибиотикограммы)обычно применяют:

• Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскла­дывают диски с антибиотиками («метод дис­ков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). Метод дисков — качес­твенныйи позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.

Читать еще:  Капли в ухо при воспалении с антибиотиком

Методы определенияминимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, кото­рый позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или пол­ностью ее стерилизует. Это количественныеметоды, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиоти­ка в крови должна быть значительно выше ми­нимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования ус­тойчивых микробов.

Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков.Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.

Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с ин­струкцией.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинако­вом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чув­ствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо приме­нять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувстви­тельность микроорганизмов методом серийных разведений.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений.Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в буль­оне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добав­ляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10 6 —10 7 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питатель­ной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя про­бирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий под влиянием содержа­щейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.

Оценку результатов определения чувствительности микро­организмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штам­мов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаружи­ваемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, созда­ющиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост кото­рых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека.В штатив устанавливают два ряда проби­рок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пеницил­лина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина — Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика опреде­ляется умножением наибольшего разведения исследуемой жид­кости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, рав­но 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибио­тика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024- 0,313=320 мкг/мл составляет концен­трацию антибиотика в 1 мл.

Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу.В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандарт­ного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питатель­ного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды поме­щают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафило­кокка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам — Н. А. Бельская

(Согласно Приказу Министерства здравоохранения СССР № 250 от 13.03.75 г. «Об унификации методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам».)

В клинической практике чувствительными к антибиотикам считают те микроорганизмы, на которые антибиотики оказывают бактериостатическое или бактерицидное действие.

При любом лабораторном исследовании критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация антибиотика, ингибирующая (задерживающая) рост возбудителя заболевания при стандартных условиях постановки опыта.

Для определения лекарственной чувствительности оптимальным является использование чистой культуры возбудителя. Выделять культуры микробов из организма для исследования на чувствительность следует до начала лечения антибиотиками, так как под их воздействием рост возбудителя заболевания может быть полностью угнетен. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяют методом диффузии в агар с применением стандартных дисков или методом серийных разведений в жидких и плотных питательных средах.

Методы определения

Метод дисков. Взвесь изучаемой культуры засевают «газоном» (см. главу 7). В качестве посевного материала можно использовать суточную бульонную культуру или 1 миллиардную микробную взвесь, приготовленную по оптическому стандарту мутности № 10 (см. ниже). Засеянные чашки подсушивают 30-40 мин при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянного агара пинцетом накладывают бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков. Каждый диск слегка прижимают браншами пинцета, чтобы он плотно прилегал к поверхности агара. Диски накладывают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. Одну чашку можно использовать для изучения чувствительности одного штамма к 4-5 антибиотикам.

Засеянные чашки с нанесенными на них дисками помещают в термостат при 37° С на 18-24 ч. Чашки ставят вверх дном, чтобы избежать попадания конденсационной воды на поверхность посевов.

Учет результатов. Действие антибиотиков оценивают по феномену задержки роста вокруг диска (рис. 25). Диаметр зон задержки роста микробов вокруг дисков определяют с помощью линейки, включая диаметр самого диска. Между степенью чувствительности микроба к антибиотикам и величиной зоны отсутствия роста имеются следующие соотношения (табл. 10).


Рис. 25. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам (метод дисков)


Таблица 10. Определение степени чувствительности микроорганизмов к антибиотикам по величине зоны отсутствия роста

В ответе указывают, какой чувствительностью обладает исследуемый штамм, а не размер зоны задержки роста.

В ряде случаев определяют чувствительность микроорганизмов к антибиотикам в нативном материале (гной, раневое отделяемое и др.). При этом материал наносят на поверхность питательного агара и равномерно растирают по поверхности стерильным стеклянным шпателем * , а потом накладывают диски. Метод дисков для определения чувствительности микроорганизмов вследствие простоты и доступности широко применяют в практических лабораториях и расценивают как качественный метод.

* (Для тех видов микроорганизмов, которые не растут на мясопептонном агаре, как, например, стрептококки, пневмококки и другие, применяют агар с кровью или сывороткой.)

Метод серийных разведений в жидкой питательной среде. Этот метод является точным количественным методом, его применяют в научной работе и в особо важных случаях в лабораториях больниц и профилактических учреждений.

Для постановки опыта необходимо иметь чистую культуру испытуемого микроорганизма, основной раствор антибиотика, мясопептонный бульон на переваре Хоттингера, содержащий 1,2-1,4 г/л аминного азота.

Активность антибиотиков выражают в ЕД/мл или мкг/мл. Для приготовления основного раствора антибиотика используют антибиотики, имеющиеся в продаже с указанием количества их во флаконе.

Если на этикетке вместо количества единиц во флаконе дозировка указана в единицах массы, то следует иметь в виду, что 1 г активности для большей части антибиотиков соответствует 1 млн. ЕД. Из этого раствора и должны быть приготовлены требуемые разведения антибиотиков. Указания для приготовления основного раствора антибиотиков на примере пенициллина приведены в табл. 11.


Таблица 11. Получение основного раствора пенициллина

Читать еще:  Оциллококцинум антибиотик или нет

Готовят взвесь культуры микроорганизмов, выросшей на плотной питательной среде. Полученную взвесь сравнивают с оптическим стандартом мутности № 10 (см. ниже), а затем разводят стерильным изотоническим раствором натрия хлорида до 10 6 микробных тел в 1 мл. Для получения соответствующего разведения микробной взвеси готовят ряд последовательных десятикратных разведений (см. ниже).

Постановка опыта. В 12 стерильных пробирок разливают по 1 мл жидкой питательной среды. В 1-ю пробирку вносят 1 мл основного раствора антибиотика, содержащего, например, 32 ЕД в 1 мл. Содержимое 1-й пробирки перемешивают и 1 мл переносят во 2-ю пробирку, из 2-й — в 3-ю, из 3-й — в 4-ю и так до 10-й, из которой 1 мл удаляют. Таким образом, 1-я пробирка будет содержать 16 ЕД, 2-я — 8 ЕД, 3-я — 4 ЕД и т. д. Для приготовления каждого разведения используют отдельную пипетку. Содержимое 11-й пробирки служит контролем роста бактерий, а 12-й — контролем стерильности питательной среды. Во все пробирки, кроме 12-й, вносят 0,1 мл испытуемой культуры определенной густоты. Посев инкубируют в термостате в течение 18-24 ч и регистрируют результаты опыта.

Учет результатов проводят при наличии роста в контроле культуры и отсутствии роста в контроле среды. Затем отмечают последнюю пробирку с полной видимой задержкой роста микробов. Количество антибиотика в этой пробирке является минимальной ингибирующей концентрацией для испытуемого штамма и определяет степень его чувствительности к данному антибиотику. В ответе, выдаваемом лабораторией, указывают минимальную ингибирующую концентрацию.

Метод серийных разведений на плотной питательной среде. Готовят двукратные разведения антибиотика, как и при методе серийных разведений в жидкой питательной среде. Затем берут 1 часть каждого разведения антибиотика и 9 частей питательного агара, расплавленного и охлажденного до 42° С (из расчета 1 мл антибиотика + 9 мл МПА), хорошо перемешивают и наливают в чашки Петри.

Густоту (концентрацию) культуры определяют по оптическому стандарту мутности № 10 и разводят стерильным изотоническим раствором до 10 7 микробных тел в 1 мл. Бактериальной петлей наносят испытуемые культуры на поверхность питательного агара с антибиотиком. На одну чашку делают посев 20-25 штаммов. Засеянные чашки ставят в термостат при 37° С на 16-20 ч для большинства видов микроорганизмов. Чашка с питательным агаром без антибиотика, на которую наносят испытуемые культуры, является контрольной.

Учет результатов проводят при наличии роста в контрольной чашке, а минимальную ингибирующую концентрацию антибиотика определяют по последней чашке Петри, где отмечают полную задержку роста бактерий.

Метод дорожки по Флемингу. Метод применяют для определения спектра действия антибиотика. В чашке Петри с МПА стерильным скальпелем вырезают дорожку шириной 1 см и удаляют ее. Затем в пробирку с растопленным и охлажденным до 42-45° С мясопептонным агаром вносят определенную концентрацию раствора антибиотика. Содержимое пробирки перемешивают и выливают в дорожку так, чтобы жидкость не выходила за ее пределы. После застывания агара перпендикулярно к дорожке засевают петлей культуры нескольких исследуемых микроорганизмов. Посевы помещают в термостат на 18-24 ч.

Учет результатов. Чувствительные к препарату культуры начинают расти лишь на некотором расстоянии от дорожки, нечувствительные растут до самого края.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ. КРИТЕРИИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ (МИК, МБК).

Критерий чувств-ти микробов к антибиотикам-это их конц. В сыворотке крови и др. Биотопах микроорг. После введения среднетерапевтических и высших доз препаратов

Минимальная концентраця — мера чувствительности микробов, т.е. конц, которая подавляет рост микробов на питательных средах в стандарт. условиях.

Критерии оценки чистых культур:

  1. МИК//МПК-минимальная ингибирующая конц.//мин. подавляющая конц.-наиб. Разведение препарата, тормозящее рост культуры в стандарт усл.
  2. МИК50-в данной конц. антибиотка чувств-но 50% исследуемых штаммов.
  3. МИК90- «_» 90% «_»
  4. МБК- мин. бактериальная конц.- мин. конц. антимикроб. Препарата, вызывающего полную гибель бактерий в стандарт. усл.

Для антибиотиков аминогликозидов, фторохинолов, амфотерицинаВ характерен доза-зависимый эффект-микроогрг. элиминируются быстрее, когда конц. антибиотика выше МИК для возбудителя.

Для в-лактамных антибиотиков, гликопептидов характ. Время-зависимый эффект.

Клас. бакт. по степени чувств-ти.

  1. Чувтвительные-подавляются конц. препатарата среднетерапевтической дозы.
  2. Умерено чувств-ые- «_» максимальной дозы.
  3. Устойчивые//резистентные-рост не подавляется даже при введени макс. кол-ва препарата.

Принципы определения чувствительности микроорганизмов

  1. Диффузия препарата в агар из бумажных дисков//полосок//лунок
  2. Серийные разведения в бульоне//плотной пит среде.

ДИФФУЗИОННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ (ДИСКОДИФФУЗИОННЫЙ МЕТОД И Е-ТЕСТ).

Диффузионный метод основан на регистрации диаметра зоны ингибиции (задержки) роста исследуемого микроорганизма. Метод менее чувствителен и менее точен, чем метод стандартных разведений, но на практике применяется чаще из-за своей простоты. Следует помнить, что скорость диффузии в агаре любого препарата зависит от его структуры, молекулярной массы, наличия примесей, состава и рН среды.

Метод бумажных дисков (дискодиффузионный метод).

Метод наиболее прост и широко используется в клинической практике. Образование зоны ингибиции роста происходит в результате диффузии антибиотиков из носителя (диска) в питательную среду (рис. 11). В определенных пределах величина диаметра зоны ингибиции роста жестко связана с величиной МИК. Метод позволяет лишь косвенно судить о величине МИК. Основным результатом является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности.

Для проведения этого метода используют стандартные диски, содержащие определенное количество антибиотиков, и стандартную питательную среду, необходимую для роста данного вида микроорганизма. Из суточной микробной культуры готовят взвесь на физиологическом растворе (1 млрд. микробных тел в 1 мл) и разводят ее в 10 раз. На поверхность чашки с плотной средой наносят 1 мл микробной культуры и покачиванием чашки или стерильным шпателем равномерно распределяют ее по всей поверхности среды. Остаток удаляют пипеткой или сливают в дезинфицирующий раствор. Среду подсушивают 10-15 мин при комнатной температуре, после чего на поверхность газона стерильным пинцетом накладывают диски с антибиотиками (не более 6 на чашку диаметром 10 см) на расстоянии >1,5 см друг от друга и от краев чашки. Условия инкубации зависят от вида микроорганизма (для большинства видов – в термостате при 37оС 24 часа).

Учет проводят в падающем свете на фоне темной поверхности, измеряя диаметр зоны задержки роста (с учетом диаметра диска). Оценку результатов проводят по специальной таблице (обычно прилагается к набору дисков для определения чувствительности к антибиотикам) путем сопоставления диаметра зон задержки роста испытанной культуры с пограничными значениями диаметра зоны в таблице. Исследуемую культуру относят к одной из трех категорий: чувствительная, умеренно-чувствительная и устойчивая.

Описанный метод является полуколичественным. Для получения количественных результатов используют методы серийных разведений.

Е-тест (E-test или эпсилометрический метод).

Метод близок по технологии постановки к методу бумажных дисков. В качестве носителя используется узкая полоска полимера (0.5х6.0 см), пропитанная различными концентрациями антибиотиков (от минимальных до максимальных). Ингибиция роста микроорганизма вокруг полоски носителя происходит в зоне, где концентрация антибиотиков, диффундирующего из носителя, выше МИК (рис. 12). Концентрации антибиотиков нанесены на соответствующем отрезке поверхности носителя. Величину МИК учитывают в том месте, где граница зоны ингибиции роста вплотную подходит к носителю. Е-тест сочетает простоту постановки метода бумажных дисков и точность метода серийных разведений.

МЕТОДЫ СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

Позволяют количественно оценить чувствительность выделенного микроба к антибактериальным средствам и определить МИК препарата. Методы серийных разведений основаны на прямом определении величины МИК. Для определения величины МИК заданные концентрации антибиотиков вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма. После инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают метод серийных разведений в бульоне, метод серийных разведений в агаре.

В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют также методы серийных макро – и микроразведений.

Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций антибиотиков или даже одной концентрации, соответствующих пороговым (то есть концентрациям, отделяющим чувствительные микроорганизмы от промежуточных и промежуточные от резистентных). Метод обеспечивает получение качественных результатов, позволяющих отнести исследуемый микроорганизм к определенной категории чувствительности, и часто используется в коммерческих тест-системах.

Метод серийного разведения антибиотика в питательной среде (бульоне).

Первоначально готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотиков в специальном растворителе. Из него готовят ряд убывающих разведений антибиотиков в пробирках с бульоном (чаще двухкратные) и добавляют испытуемую культуру (обычно 10 5 -10 6 бактериальных клеток). Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотиков. Сроки инкубации зависят от вида микроорганизма (чаще сутки). Определяют МИК, которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста (прозрачная питательная среда). Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) из нескольких последних пробирок с задержкой роста делают посев петлей на сектора чашки Петри. За МБК, которая, как правило, на несколько разведений меньше МИК, принимают концентрацию препарата в последней пробирке, посев из которой не дал роста.

Читать еще:  Норбактин антибиотик или нет

Метод серийных разведений в плотной питательной среде.

Этот метод более чувствителен и точен, чем метод бумажных дисков. Каждый антибиотик испытывают, как правило, в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару. Агар с антибиотиками разливают в чашки Петри. Контролем служит чашка с агаром без антибиотиков. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотиков 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе). Учет роста в термостате осуществляют спустя сутки. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет роста ни одной колонии.

чувствительные культуры– их рост подавлен всеми тремя концентрациями (можно применять антибиотики в средней терапевтической дозе);

среднечувствительные (можно применять антибиотики только в увеличенной дозе) – рост подавляют вторая и третья концентрация антибиотиков;

умеренно-устойчивые подавляет только третья наиболее высокая концентрация (антибиотики применяют только местно);

устойчивые (антибиотики применять нельзя по тестам in vitro) — растут на всех трех концентрациях.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Современная мировая ситуация с резистентностью микроорганизмов. Перечень устойчивых микроорганизмов. Национальный план по борьбе с антибиотикорезистентность. Диско-диффузный метод — классика определения чувствительности бактерий к антимикробным препаратам

Современная мировая ситуация с резистентностью микроорганизмов. Перечень устойчивых микроорганизмов. Национальный план по борьбе с антибиотикорезистентность.

Диско-диффузный метод — классика определения чувствительности бактерий к антимикробным препаратам.

Устойчивость микроорганизмов к антимикробным препаратам – серьезная проблема для мирового здравоохранения.

Сегодня установлено, что бактерии выработали резистентность даже к карбопенемам – наиболее сильным антибиотикам для лечения инфекций, вызванных устойчивыми анаэробами и энтеробактериями.

Существует много методик, направленных на определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам – Е-тест, методы разведения, диско-диффузный метод.

Последний является классикой лабораторного определения чувствительности бактерий, сегодня чаще всего именно он применяется в бактериологических лабораториях.

Современная ситуация с резистентностью микроорганизмов

Открытие антибиотиков стало настоящим прорывом в медицине, позволившим предотвратить гибель миллионов человек от инфекционных патологий. Однако со временем возбудители опасных заболеваний развили в себе механизмы формирования устойчивости в данным лекарственным препаратам.

На протяжении десятков лет ученым удавалось разработать новые средства, опережая тем самым изменяющихся возбудителей.

Но по мере нарастания активности использования антибиотиков в медицине росло число устойчивых штаммов микроорганизмов. Сегодня выпуск антимикробных препаратов с новыми механизмами действия практически прекращен.

И если еще 40-50 лет назад случаи инфицирования человека антибиотико-резистентным штаммом были крайне редки, то сегодня ситуация с устойчивыми к антибиотикам бактериями принимает угрожающие масштабы.

Ситуация осложняется тем, что появляются микроорганизмы, устойчивые к нескольким иди даже ко всем существующим антимикробным средствам, обычно использующимся медиками для лечения инфекционных заболеваний. Это так называемые «супермикробы» или «супербактерии» — микроорганизмы с множественной лекарственной устойчивостью.

Несмотря на всю серьезность ситуации, данные о масштабах и последствиях антибиотикорезистентности пока отсутствуют, а регулярный эпиднадзор за этим явлением в большинстве стран мира зачастую основан на результатах анализа образцов, взятых у пациентов с тяжелыми инфекциями, в частности, с ИСМП.

Согласно статистике, только в США и странах Европы каждый год от инфекций, вызванных антибиотико-резистентными штаммами микроорганизмов, погибает около 50 тысяч человек. Предполагается, что к 2050 году число погибших возрастет до 10 миллионов в год.

Устойчивость к антибиотикам – проблема, напрямую касающаяся всего общества и определяемая целым рядом взаимосвязанных факторов. Поэтому отдельные изолированные усилия не принесут существенных результатов, необходимы согласованные действия.

Так, два года назад 68 Всемирная ассамблея здравоохранения разработала Глобальный план действий по борьбе с резистентностью к антимикробным препаратам.

Было выражено мнение, что устойчивость бактерий угрожает здоровью и жизни человека. Одна их целей Глобального плана – упрочить доказательную базу путем укрепления исследований и глобального мониторинга.

По инициативе ВОЗ разработана Глобальная система эпидемиологического надзора за устойчивостью к антимикробным препаратам, в которую вошли 43 страны мира. Ее цель – поддержание стандартизированного подхода к сбору, анализу и обмену данными об устойчивости к антибиотикам.

На первых этапах система сосредоточится на бактериальных патогенах у людей.

Система будет собирать, анализировать и проверять сопоставимую информацию по антибиотикорезистентности со странами и партнерами для осведомления о процессе принятия решений, реализации местных, национальных и региональных действий и предоставления доказательств для вмешательства и защиты.

Наша страна вошла в Центрально-Азиатскую и Восточноевропейскую сеть эпидемиологического надзора за устойчивостью к антимикробным препаратам (CAESAR), разработанную Европейским региональным бюро ВОЗ.

Сегодня по всей России разработана система мониторинга антибиотикорезистентности – AMRmap. В нее включены сведения об устойчивости микроорганизмов из 52 городов РФ с 1997 по 2016 год.

Устойчивые микроорганизмы: список

ВОЗ определил список бактерий, резистентных к антимикробным препаратам. Для борьбы с ними необходима разработка новых антибиотиков. Все микроорганизмы разделены на группы по приоритетности разработки новых лекарств.

Они представлены в таблице ниже.

К каким антибиотикам устойчивы

Enterobacteriaceae (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus spp., Providencia spp, Morganella spp)

Возбудители туберкулеза не вошли в перечень, так как борьба с ними является объектом внимания других специальных программ.

При составлении вышеуказанного перечня ВОЗ использовал следующие критерии:

  • смертность от заболеваний, вызванных устойчивыми микроорганизмами;
  • наличие или отсутствие необходимости помещения больного в стационар с целью лечения инфекционной патологии;
  • частота случаев резистентности к существующим на сегодняшний день антибиотикам;
  • легкость передачи инфекции зоонозным и антропонозным путями;
  • возможность предупреждения при помощи вакцинации и соблюдения пищевой гигиены;
  • количество вариантов лечения, имеющихся в распоряжении медиков.

Список составлен с целью стимуляции исследований и разработок в сфере создания новых антимикробных средств как из бюджетных средств, так и за счет частных инвестиций.

Национальный план по борьбе с антибиотикорезистентностью

Научно-исследовательская и опытно-конструкторская деятельность жизненно необходима в борьбе с лекарственной устойчивостью бактерий, однако сама по себе данная мера проблему не решит. Необходимо повышать осведомленность о проблеме антибиотикорезистентности и совершенствовать эпиднадзор за устойчивыми штаммами.

Это направление борьбы стало одним из основных, лежащих в основе проекта Минздрава «Стратегии предупреждения и преодоления устойчивости микроорганизмов и вредных организмов растений к лекарственным препаратам, химическим и биологическим средствам на период до 2030 года и дальнейшую перспективу».

В основе отечественной стратегии лежат пять направлений:

  • повышение осведомленности о проблеме антибиотикорезистентности бактерий;
  • совершенствование эпиднадзора за устойчивыми штаммами;
  • разработка новых антимикробных препаратов;
  • создание финансовой основы для того, чтобы исследования не прекращались;
  • совершенствование диагностических методик и внедрение обязательных лабораторных анализов, нацеленных на выявление резистентности бактерий в ЛПУ.

Определение устойчивости микроорганизмов к антибиотикам при помощи диско-диффузного метода: выбор питательных сред

Диско-диффузный метод определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам является наиболее распространенным.

Он подходит для исследования большей части возбудителей инфекций, в том числе и для микроорганизмов со сложными питательными потребностями. Методика универсальна и не требует специального оборудования.

Для того, чтобы обеспечить максимальную точность полученных результатов, необходимо следовать требованиям, изложенным в нормативной документации. В соответствии со стандартами, для определения чувствительности микробов диско-диффузным методом допустимо использовать любую питательную среду данного назначения, разрешенную в России.

Для бактерий с обычными питательными потребностями это агар Мюллера-Хинтон, АГВ, изосенситест, а также питательная среда для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.

Для бактерий со сложными питательными потребностями рекомендованы две среды — специальная среда Haemophilus Test Medium для тестирования H. Influenzae и агар Мюллера-Хинтон с добавлением 5% бараньей крови для тестирования Streptococcus pneumoniae, стрептококков групп A, B, C, G и др.

Проблема резистентности бактерий к антибиотикам носит многоплановый характер и требует комплексного подхода к ее решению. Оборудование микробиологических лабораторий высококачественными препаратами для тестирования позволит получать достоверные и сопоставимые результаты.

Это даст возможность, с одной стороны, проводить эффективные терапевтические мероприятия, а с другой — собирать и анализировать информацию для слежения за появлением и распространением устойчивости бактерий к антибиотикам.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector